دایر کردن آزمایشگاه کشت سلولی: تجهیزات پایه مورد استفاده در کشت سلولی

آزمایشگاه کشت بافت نیاز به تامین CO2 و دیگر گازهاست که به محفظه تحویل داده شود. یک لوله سیلیکانی که با اتوکلاو استریل شده است، جهت اتصال منبع گاز به انکوباتور مورد استفاده قرار می گیرد. نکته مهم در مورد انکوباتور این است که نباید جریان گاز قطع شود. یک فیلتر 2/. میکرومتری جهت جلوگیری از ذرات خاک و دیگر آلوده کنندگان وجود دارد. دارای یک عایق می باشد که به صورت پوشش آبی و هوایی می باشد. پوشش آبی انکوباتور  می تواند دما را برای مدت طولانی حتی هنگام خاموش بودن انکوباتور بالا نگهدارد.

انکوباتور در هنگام پر بودن سنگین است  و بایستی در زمان جابه جایی، آب آن را خالی کرد. در عوض پوشش هوایی سبک است. طرح های داخلی  و مواد مورد استفاده می تواند تعیین کند که محیط کشت عاری از میکروب است. چون میکروب ها بر روی ظروف استیل، نوارهای برچسب و حتی پلاستیک رشد می کنند  بایستی قفسه ها به راحتی قابل جابه جا باشند تا در هنگام نیاز، آنها را تمیز کرد. قفسه های مسی و دیوار های داخلی می توانند مانع رشد میکروب ها شوند اما خیلی گران هستند. باید همه سخت افزار ها مسی باشند، یکی به تنهایی نمی تواند  به طور کامل مانع از رشد میکروب ها شود. تمیز کردن معمولی قفسه های استیل یا آلومینیم با یک ماده ضد عفونی کننده  و شستشو با اتانول در کاهش ریسک کمک می کند. در استفاده کردن از مواد ضد عفونی کننده باید دقت شود. بسیاری ازاین مواد فرار هستند و سلول ها را می کشند. اتاقک انکوباتور  بایستی یک شب قبل از برگرداندن محیط کشت یعنی یک شب بعد از اینکه تمیز کاری شد، خالی باشد. انکوباتور روی 37 درجه  و کربن دی اکسید 5/. برای نگهداشتن محیط کشت در PH مناسب قرار می گیرد. همه آنها دارای وسایلی جهت ثبت دما و گاز هستند. دستگاه های هشدار دهنده، جهت هشدار دادن  در زمان خارج شدن از حالت صحیح ، وجود دارد. توانایی برای گرفتن یک عکس مستقیم میکروسکوپی اهمیت زیادی دارد.

ظروف پلاستیکی کشت بافت، در طرح های مختلف در دسترس می باشند. از طرح های ساده تا طرح های 6-12-24-48 تا 96 و همچنین لوله های آزمایش.

ظروف پلاستیکی اگرچه گران هستند، اما بر شیشه، جهت پیپت و ظروف کشت بافت ترجیح داده می شوند. ظروف شیشه مورد استفاده برای کشت بافت، بایستی با بخار داغ به مدت 30 دقیقه و در فشارin/ b15حرارت ببینند. بطری های خالی با ورقه آلومینیم پوشانده شوند و درب بطری های پر هم بایستی محکم بسته شود.

در محیط کشت استاندارد، آب بایستی به صورت قابل اعتماد باشد. تعداد بسیار زیادی از سلول ها وجود دارند که در شرایطی که آب مناسب نباشد، رشد نمی کنند.

فریزر

نیتروژن مایع برای ذخیره سازی طولانی مدت کشت سلول به کار می رود که این می تواند واحد قابل حمل باشد، که می توان هر موقعی که به آن نیاز باشد جابه جا شود و 2500 ویال را در خود جا می دهد. این واحد با NO2 مایع به صورت دستی پر می شود.. ضروری است که مرتب سطوح نیتروژن را بررسی کنیم. سلول ها ممکن است در دمای 80- در جه به صورت یخ زده برای دو سه ماه نگهداری شوند. اما تعدادکمی از سلول ها، در این دما توانایی خود را از دست می دهند.

آب مورد استفاده نبایستی از آب لوله کشی باشد. منبع آب بایستی چک شود. آب بطری ها در بیشتر موارد بهتر از دیگر آبها است. برخی سلول ها نسبت به سلول های دیگر حساسیت بیشتر ی نسبت به آب دارند. به هر حال همه سلول ها نسبت به آب حساس اند  و مهم است که کنترل شود.

نوع محیط کشت انتخاب شده  وابسته به نوع سلول می باشد. محیط کشت با آنتی بیوتیک پنی سیلین و استرپتومایسین ضدعفونی می شود. محیط کشت فیلتر شده و در دمای 4 درجه حرارت می بیند.

محیط کشت:

مخلوط مواد غذایی که معمولا برای کشت سلول ها استفاده می شود محیط کشت(media) نامیده می شود. معمولا این مخلوط با سرم یا دیگر مایعات  بیولوژیکی مانند پلاسما و شیر یا با یک مخلوط معین از هورمون ها و فاکتور های رشد، تکمیل می شود.

این مهم است که در محیط کشت عاری از سرم، فلزات سنگین و ترکیبات آلی موجود در بعضی آب های مقطر و دیونیزه شده  می تواند به شدت باعث اثرات توکسیکی برای انواعی از سلول ها شود.

مخلوط مواد غذایی موجود در محیط کشت، سنگ بنای هر محیط کشت می باشند و موفقیت  یا عدم موفقیت در انجام کشت سلولی توسط آن صورت می پذیرد.

مخلوط مواد غذایی تنها می تواند با استفاده از کمپلکسی از مایعات جایگزین شود که حتی بعضی مواقع هم در رشد سلول ها نقض ایجاد می شود. محیط کشت، مواد غذایی ضروری که در تقسیم سلولی شرکت دارند همچون آمینواسیدها، اسید های چرب، قند، یون ها، ویتامین ها، کوفاکتورها و مولکول های ضروری برای حفظ محیط شیمیایی مناسب سلول را تامین می کنند.

بعضی ترکیبات هر دو نقش را بازی می کنند. برای مثال سدیم بیکربنات ممکن است بعنوان منبع کربنات استفاده شود اما همچنین ممکن است نقش مهمی در حفظ PH محیط بازی کند.

محیط کشت دارای اسید آمینه ضروری و غیر ضروری می باشد و همچنین حاوی لیپید ها که معمولا مخلوطی از اسیدهای چرب هستند می باشد. بعضی هم حاوی لیپیدهای پیچیده هستند. برخی از محیط های کشت حاوی ماکرومولکول هایی همچون تیمیدین، آدنوزین و هیپوگزانتین می باشند که بوسیله سلول در محیط کشت نیز می تواند ساخته شوند. اضافه کردن این مواد به محیط کشت می تواند رشد سلول را به وسیله حفظ استخر پیش ماده ها بهیود بخشد.

بسیاری از محیط های کشت حاوی ویتامین های معمولی مانند نیاسین، اسید فولیک، ریبوفلاوین و..... هستند. ویتامین های   AوD و Cبه فورمولاسیون اضافه نمی شوند چرا که ناپایدارند .هرچند که ممکن است برای برخی سلو لها سودمند و حتی ضروری باشند و اضافه شوند. آنها ممکن است در حفظ حالت تمایزی سلول دخالت کند، در تنظیم عملکرد سلول یا بعنوان آنتی اکسیدان نیز عمل کنند. اکثر محیط های کشت حاوی منبع انرژی می باشند که معمولا گلوکز است که مقدار آن متفاوت است.(بین 8/. تا 5 گرم در لیتر)

 آمینواسیدها و گلوکز و همچنین یون هایی همچون NaCl دارای نقش تغذیه ای می باشند و همچنین در اسمولالیته محیط کشت دخالت دارند.

علاوه بر سیستم بافری بی کربنات  محیط کشت ممکن است دارای بافرهای فسفات و بافر های آلی پیچید ه باشد. بیشتر محیط های کشت دارای فنل رد بعنوان اندیکاتور PH می باشند که سریعا PH محیط کشت را در کلیه کشت ها در انکوباتور را ارزیابی می کند. فنل رد می تواند به محیط کشت اضافه شود (اگر بخشی از پودر محیط کشت نباشد.) باید توجه شود که فنل رد دارای خاصیت ضعیف  استروژنی است که ممکن است روی برخی ازسلول ها اثر کند.

انواع محیط کشت

 در حال حاضر، چند محیط کشت بیشتر استفاده می شود:

 برخی از محیط های کشت [به عنوان مثال، محیط کشت حداقل ضروری (ME) ،  محیط کشت اصلاح شده (DME)] به طور خاص برای استفاده با مکمل سرم و رشد با  چگالی بالای سلولی توسعه یافته اند (دلبکو و فریمن، 1959، عقاب، 1955).

در مقابل، برخی دیگر مانند مخلوط های مواد مغذی F12 ,F10 هام و مجموعه های محیط کشت مخصوص  زیست شناسی تکوینی سلولی مولکولی (MCDB) به طور خاص برای رشد یک نوع سلول در چگالی کم (. هام 1965 و McKeehan، 1979) طراحی شده اند.

 محیط کشت Leibovitz( (L-15که برای رشد سلول ها در هوا به جای CO2 طراحی شده است  وقتی مفید است که انکوباتورهای CO2 (به عنوان مثال، آزمایشگاه آموزشی) در دسترس نباشند، و یا هنگامی که سلول ها به طور گسترده حمل یا  در خارج از انکوباتور به کار گرفته می شوند (به عنوان مثال، در طول یک پروتکل تفکیک طولانی مدت بافتی).

معمولا محیط کشت ها برای رشد سلول های پستانداران دارای ترکیبات مشابه اند، در حالی که محیط کشت های  سلولی حشرات (به عنوان مثال، محیط کشت گریس) کاملا متفاوت می باشند، بنابراین منعکس کننده نیازهای مختلف سوخت و ساز سلول های حشرات می باشد.

توجه داشته باشید که ترکیب و غلظت اجزای چند محیط کشت از نظر کیفی و کمی متفاوت است.

محیط کشت های معمول مورد استفاده

•  تنظیم CO2 انکوباتورها برای مطابقت با محیط مورد استفاده بایستی به دقت انجام شود.
• فرمول هر محیط کشتی که با ترکیبات خاص برای کار با غلظت CO2 مشخص طراحی شده است (بیشتر در محدوده از 0 تا 10٪ مخلوط CO2 هوا)  تا بتواند یک سیستم بافری بی کربنات برای  pH 7.0- 7.4 ارائه کند.
• عدم تطابق سطح بی کربنات محیط کشت و سطح  CO2انکوباتور باعث ایجاد pH غیر طبیعی و خارج از محدوده در محیط کشت برای رشد سلول می شود.  در نتیجه رشد سلول ها کندتر شده  یا به مرگ سلول ها منجر می شود.

اگر محیط کشت های طراحی شده برای استفاده با سطوح مختلف CO2 در همان انکوباتور استفاده شود، سطح بی کربنات باید طوری تنظیم شود که همه بافرها به درستی در همان سطح CO2 انکوباتور قرار داشته باشند.

• در هنگام ساختن محیط کشت، توانایی تغییر غلظت بی کربنات، یکی از مزایای محیط کشت مایع در آزمایشگاه نسبت به پودرهای تجاری می باشد.
• ملاحظاتی که باید در هنگام  تغییر سطح بی کربنات در نظر داشته باشیم عبارتنداز:  غلظت بی کربنات  برای برخی از انواع سلول ها مهم است؛ تغییر بی کربنات باعث تغییر ظرفیت کل بافری محیط کشت می شود؛ و تغییر بی کربنات باعث تغییرات اسمولاریته محیط کشت می شود.
•  اگر لاین جدید سلولی به آزمایشگاه آورده شود، نوع محیط کشت توصیه شده برای رشد آن را  تعیین کنید.
•  این اطلاعات را می توان از همان منبع تهیه سلول ها به دست آورد.
• به خاطر داشته باشید، اگر محیط کشت توصیه شده با تنظیمات CO2 ، در انکوباتور مورد استفاده برای رشد سلول های دیگر در آزمایشگاه ناسازگار است، و یا به طور معمول در آزمایشگاه آماده نیست، ممکن است مایل به تغییر محیط کشت باشید.
• هنگامی که سعی به تکرار داده های منتشر شده دارید، ممکن است رشد سلول ها در یک محیط کشت دیگر پاسخ های متفاوتی  در برخی از پارامترهای اندازه گیری نشان دهد.
•  به عنوان مثال، سلول های نیازمند به استروژن که قبلا در محیط کشت F12 رشد کرده و سپس به محیط کشت DME منتقل شده اند؛ ممکن است یک پاسخ کاهشی به افزایش استروژن خارجی در این محیط کشت نشان دهند. چون فنل قرمز موجود در محیط کشت فعالیت استروژنی ضعیفی،  در غلظت های  بسیار بالا در محیط کشت دارد.
•   اگر کسی بخواهد رشد یک سلول اولیه را که هیچ اطلاعات منتشر شده ای درباره رشد آن  در شرایط آزمایشگاهی وجود ندارد مطالعه کند، یا کسی علاقمند  به مطالعه رشد سلول ها به شیوه ای متفاوت (به عنوان مثال، با مکمل های تعریف شده و نه از سرم) باشد، بهتر است چند محیط کشت تجاری در دسترس را قبل از تصمیم گیری درباره انتخاب یکی از آنها مورد بررسی قرار دهد.  
• برای این منظور می توان پنج تا ده پودر محیط کشت مختلف از یک منبع تهیه کرد و همه آنها را در آزمایشگاه با استفاده از آب و اجزای مکمل یکسان آماده نمود، و  سپس رشد سلول را در هم آنها به طور مستقیم مقایسه کرد.
• در صورت نیاز به  نتایج پایانی دیگری به غیر از رشد سلول ها ، اندازه گیری های مورد نظر را در هر یک از محیط های  کشت  انجام دهید.

آماده سازی محیط کشت

•  محیط کشت می تواند به صورت محیط کشت های مایع آماده خریداری شود، یا در آزمایشگاه از پودر خشک حاوی مواد مختلف مواد مغذی ساخته شود، و از ترکیب اجزای مختلف جداگانه در آزمایشگاه تهیه شود.
•  خرید محیط کشت مایع، به خصوص برای کار با محیط کشت بدون سرم توصیه نمی شود. اجزای محیط کشت، به ویژه به صورت محلول، با گذشت زمان خاصیت خود را از دست می دهند. بعضی از ترکیبات ضروری که تجزیه می شوند، سریع تر از بین می روند. سایر مواد محصولات  سمی تولید می کنند و یا به اجزای سمی اکسید می شوند.
•  برخی از محیط کشت های مایع آماده را می توان منجمد کرد. ولی محیط کشت هایی که در هنگام ذوب تولید رسوب می کنند را  نباید منجمد کرد.
•  ما به این نتیجه رسیدیم که زمان 2 هفته ای برای ذخیره سازی محیط کشت های بدون سرم  مناسب است، و یا اگر سرم اضافه شده است زمان نگهداری محیط کشت طولانی تر می شود. در حالی که این شرایط با توجه به نوع سلول و با نوع محیط کشت های تکمیل شده با سرم یا بدون سرم متفاوت است.
•  محیط کشت های تاریخ گذشته را می توان برای شستشوی سلول ها و یا آماده سازی بافت ها برای کشت اولیه استفاده کرد.
•  در هر صورت، بهتر است که همیشه محیط کشت آماده پودری را ذخیره کرد و محیط کشت مایع  را در آزمایشگاه به طور منظم تهیه نمود.
•  به طور کلی، مخلوط مواد مغذی پودری دارای عمر مفید یک سال یا بیشترند. البته در صورتی که در  ظروف ضد رطوبت و محفوظ از هوا،  در تاریکی ذخیره شوند.
•  اگر آزمایشگاه حجم زیادی از محیط کشت را  استفاده نمی کند، بسته های 1 لیتری مناسب هستند.
•  تهیه محیط کشت در آزمایشگاه از اجزای مورد نیاز، بلافاصله قبل از استفاده،  بهترین راه است تا مطمئن شویم که محیط کشت شامل اجزای مورد نظر را در فرم مورد نظر دارد. اگر محقق بخواهد به مطالعه نقش مواد مغذی خود و به دنبال بهینه سازی هر یک از مواد مغذی محیط کشت می باشد، این فرایند ضروری می نماید.
•  با این حال، اکثر آزمایشگاه ها می دانند که تهیه محیط کشت از مخلوط مواد مغذی پودر تجاری و ذخیره سازی محدود از محیط کشت های آماده در یخچال کم نور برای رفع نیازهای آنها کافی خواهد بود.
•  همه عوامل آنتی بیوتیک تا حدودی سمی هستند، بنابراین هر آنتی بیوتیک مورد استفاده باید در محدوده غلظت تعریف شده در سلول های مورد علاقه تست شود.
•  سرم را می توان هنگام ساختن به محیط کشت اضافه کرد و مخلوط حاصل را فیلتر کرد.
•  با این حال، از آنجا که سرم عمر مفید طولانی تری نسبت به محیط کشت دارد و سلول های مختلف ممکن است سطوح متفاوت و یا انواع سرم های مختلف را  نیاز داشته باشند، ما به این یافته رسیدیم که بهتر است محیط کشت را بدون سرم تهیه کرد و  سرم استریل را به طور جداگانه ذخیره نمود، و آن را بر حسب نیاز به محیط کشت اضافه کرد.
• هنگام استفاده از فیلترهای یکبار مصرف،  بایستی30 تا 100 میلی لیتر از محیط کشت فیلتر شده ابتدایی دور ریخته شود. تا از آلوده شدن محیط کشت با مواد شیمیایی شستو دهنده فیلتر جلوگیری شود.
•  بطری های محیط کشت باید دارای برچسب و تاریخ باشند و در دمای 4 درجه سانتیگراد ذخیره شوند.

 تیمار سرم

•  محیط های کشت سلولی می تواند با سرم هر گونه دام مکمل شود. مانند گاو (جنین، نوزاد، یا بزرگسالان)، اسب، و یا سرم های انسانی که اغلب استفاده می شود.
•  علاوه بر این، سرم از حیوانی به حیوان دیگر متفاوت است، با تغییرات در رژیم غذایی، و فصلی. بنابراین، تنوع قابل توجهی در سرم های تجاری در دسترس وجود دارد.
•  علاوه بر تمام سرم ها، با توانایی تشکیل لخته و یا حذف لخته، خون را می توان با یک عامل ضد لخته و اجزای سلولی چرخاند و در نتیجه پلاسما را جمع آوری کرد.
•  حتی سرم و پلاسمای یک حیوان از نظر ترکیب و اثر  بر سلول ها کاملا متفاوت می باشند.
•  سرم ها را می توان قبل از استفاده به یک یا چند روش تیمار کرد: فیلتراسیون، عملیات حرارتی، و یا جزء به جزء کردن.
• این تیمارها می توانند به عنوان یک عامل اطمینان فوق العاده در برابر آلودگی عمل کنند، می تواند باعث حذف یا غیر فعال شدن سموم از سرم، حذف یا غیر فعال شدن فعال کننده های رشد و یا عوامل متمایز کننده سرم، و به طور خاص می تواند اجزای با وزن مولکولی کم یا زیاد و یا بخش های خاص  سرم را حذف کند.
• توصیه می شود تنها راه مطمئن در رسیدن به نتایج مطلوب این است که چندین آزمایش برای توانایی سرم های مختلف در حفظ ویژگی های سلول مورد نظر (به عنوان مثال، رشد، تمایز، و یا عدم تمایز، نشانگر خاص بیوشیمیایی، تولید پروتئین، و غیره ) انجام شود و سپس مقدار زیادی از بهترین نوع خریداری شده و در دمای 80-20 درجه  سانتیگراد ذخیره سازی و از  آن برای چند سال آینده استفاده شود.
•  بیشتر سرم های تجاری به صورت استریل بسته بندی شده اند. ولی بهتر است سرمی خریداری شود که به صورت  استریل جمع آوری شده باشد، برای اطمینان بیشتر در برابر ویروس ها و یا مایکوپلاسما، که می تواند از طریق برخی از فیلترها به آن منتقل شود.
•  سرم های انسانی باید از اهدا کنندگان شناخته شده و یا بانک خون، که برای ویروس های شایع مانند ویروس نقص ایمنی انسانی (HIV) و هپاتیت بررسی شده اند تهیه شوند.

تست محیطهای کشت و کنترل  کیفیت قطعات

•  ما اعلام کرده ایم که بهتر است برای آماده سازی محیط کشت از مخلوط مواد مغذی پودر تجاری در دسترس استفاده شود.
•  مهم است برای حفظ نتایج مطلوب و انجام آزمایش کنترل کیفیت از معرفهای مورد استفاده در ساخت محیط کشت استفاده شود.
• ما به طور کلی از یک مجموعه ظروف به طور انحصاری برای ساخت محیط کشت استفاده می کنیم  و ظروف را به خوبی با آب مقطر(نه با مواد شوینده) بین هر بار استفاده، شستشو داده ایم. بنابراین از وارد شدن مانده مواد شوینده پس هر بار استفاده به محیط پیشگیری می شود.
• برای توزین این معرفها از ابزار یکبار مصرف استفاده شود. با این روش از  آلوده شدن این معرف با دیگر مواد شیمیایی سمی که ممکن است در آزمایشگاه باشد، جلوگیری می شود.
• جزء اصلی محیط کشت آب است.
•  خلوص آب برای کیفیت مطلوب محیط کشت بسیار مهم است.
• کیفیت آب  هنگامی که سلول ها در محیط کشت فاقد سرم رشد داده می شوند، اهمیت کلیدی دارد.
•  با این حال، برخی از انواع سلول به کیفیت ضعیف محیط کشت، حتی زمانی که سرم استفاده می شود،  بسیار حساس  می باشند.
•  ما دوست داریم پودرهای محیط کشت، هورمون های حیاتی و سرم ها را  تست کنیم، و به اندازه کافی از بهترین ها برای  آخر سال خریداری کنیم.
•  فرایند تست باید منحنی های رشد روزانه را نیز شامل شود، که با استفاده از آن می توان زمان دو برابر شدن جمعیت سلولی و تراکم اشباع  را محاسبه نمود.

بهینه سازی محیط کشت

• هنوز هم نیاز به آزمایش های بیشتر برای استخراج محیط کشت های بهینه برای انواع دیگر سلول (به عنوان مثال، لاین های سلولی تازه مشتق شده، لاین های سلولی انسان، و غیره) و یا نیازهای دیگر محیط کشت (مثلا، محیط کشت با چگالی بسیار  بالا، کنترل تمایز در شرایط محیط کشت) وجود دارد.
•  بهینه سازی محیط کشت که در آن یک کشت اولیه و یا لاین سلولی رشد می کند، می تواند به افزایش رشد افزایش ترشح پروتئین، افزایش زنده ماندن، افزایش ثبات فنوتیپی، و کنترل بهتر تمایز منجر شود،.
•  بهینه سازی مخلوط مواد مغذی بخش مهمی از این فرایند است.
•  بهترین راه برای بهینه سازی مخلوط مواد مغذی انجام منحنی دوز-پاسخ در هر جزء، انتخاب محدوده مطلوب برای هر جز، و تست مجدد هر جزء می باشد.
•  توجه داشته باشید که سلول ها طیف گسترده ای از غلظت برخی از اجزای محیط کشت را تحمل می کنند، اما برای دیگر اجزا، یک محدوده بسیار باریک غلظت مطلوب دارند.

محیط کشت اولیه

• انواع محیط کشت
• محیط کشت اولیه
• محیط کشت لاین سلولی

 • محیط کشت اولیه به سلول هایی اشاره دارد که از بافت منشاء به طور مستقیم در محیط کشت قرار داده می  شوند.

• این محیط کشت، تا تشکیل اولین زیر مجموعه، محیط کشت اولیه نامیده می شود.

• پس از اولین سابکالچر ، آنها را می توان محیط کشت ثانویه نامید، و پس از آن، اگر پاساژ ادامه داشته باشد ممکن است، یک لاین سلولی شکل گیرد.

• هنگامی که سلول ها از یک ارگانیسم برداشته و در محیط کشت مناسب قرار داده می شوند، متصل  شده و به رشد خود ادامه دهد به عنوان محیط کشت اولیه نامیده می شود.

• طول عمر سلول های اولیه محدود است.

 • محیط کشت اولیه شامل یک جمعیت بسیار ناهمگن از سلول ها می باشد.

• زیر کشت سلول های اولیه منجر به تولید لاین های سلولی می شود.

• سلول هایی مانند میوسیت ها، ماکروفاژها و سلول های عصبی را که در شرایط آزمایشگاهی تقسیم نمی شوند می توان به عنوان محیط کشت اولیه استفاده کرد

•. در حالی که اکثر مطالعات کشت سلولی از لاین های سلولی منتشر شده استفاده می کند، در برخی از موارد کشت اولیه ترجیح داده می شود.

5. تمایل به مطالعه انواع سلولی متمایزشده معمولی، مانند سلول های عصبی، میوسیت، و یا سلول های T در شرایط آزمایشگاهی، بدیهی است که به محیط کشت اولیه نیاز دارد، در صورتی که این نوع سلول را در داخل بدن تقسیم نمی شود.
5. علاوه بر این، ثابت شده است که برخی از سلول های با قابلیت تقسیم،  نمی توانند عملکرد تمایزی خود را در شرایط آزمایشگاهی بعد از چند مرحله پاساژ حفظ کنند.

• در هر صورت، انجام کشت اولیه به منظور مطالعه خواص سلول های که به تازگی از بدن جاندار برداشت شده اند، به منظور کسب اطلاعات بیشتر در مورد عملکرد انها در داخل بدن مورد نیاز می باشد.

• این محیط کشت ها می تواند شامل انواع متفاوتی سلول و یا شامل عمدتا یک نوع سلول باشند. با این حال، محیط کشت های  اولیه به ندرت از یک نوع سلول  خاص تشکیل می شوند.

• در کشت سلولی اولیه، امکان خالص سازی یک نوع سلول مورد نظر به روش مکانیکی و یا آنزیمی در ضمن تفکیک بافت وجود دارد.

• در مرحله بعد، محیط کشت های اولیه را می توان برای انتخاب و بقای تنها یک نوع سلول انتخاب کرد (انتشار لاین سلولی)  

• اشکالاتی از محیط کشت اولیه :

1. آماده سازی و نیاز به استفاده از حیوانات زنده یا بافت تازه اغلب وقت گیر است.

2. تنوع قابل توجهی از یک آماده سازی تا آماده سازی دیگر ، به خصوص اگر توسط افراد مختلف آماده شده باشند، وجود دارد.

3. در نهایت، کشت های سلولی به طور مداوم از زمان خارج کردن سلول ها از بدن تا زمانی که بمیرند و یا به شرایط محیط کشت عادت کنند، در حال تغییر می باشند.

4. این تغییرات می تواند شامل ترکیب انواع سلول ها در محیط کشت، تغییر در شکل سلول، تغییرات در همکاری سلول- سلول، و تغییرات در عوامل مترشحه از سلول ها و گیرنده ها و دیگر پروتئین های سطح سلول که در حال حاضر در سلول وجود دارند می شود.

5. محیط کشت اولیه از بافت جوندگان به طور معمول می تواند از بزرگسالان، نوزادان و حیوانات جنین به دست آمده باشد. 6. مزیت استفاده از بافت های بالغ معمولا حجم بافت های موجود برای برداشت است. اما اگر محقق علاقه مند به ایجاد یک لاین سلولی بلند مدت از یک نوع سلول خاص است، بافت نوزاد و یا جنین دارای مزیت ارائه یک جمعیت که سرعت تقسیم سلولی دارد و در دراز مدت ظرفیت تمایزی بزرگی دارد و می تواند اغلب سلول جاودانه ای را شکل دهد.

5. نکات کلی برای تهیه یک محیط کشت اولیه  عبارتنداز:

1. آزمایش های اولیه عوامل مختلف اغلب می تواند در 24-48 ظرف کشت بافت به خوبی انجام شود( برای به دست آوردن اطلاعات حداکثر با بافت کم).
2. دیدن سلول ها در ظرف کشت و بررسی بصری آنها غالبا اهمیت زیادی دارد.
3. خلوص سلول، عملکرد سلول و یا به حداقل رساندن آسیب سلول باید اولویت اصلی در طراحی پروتکل شما باشد.
4. نشانگرهای مورد استفاده در سلول های مورد علاقه و عملکرد و خلوص سلول در سراسر محیط کشت را تعیین کنید. داشتن بیش از یک نشانگر به ویزه اگر سلول ها در کشت های مقدماتی بلند مدت مورد مطالعه قرار می گیرند و یا یک لاین سلولی به دست آمده است اهمیت یژه ای دارد. پس از تفکیک، زنده ماندن آنها را بررسی کنید. اگر سلول های مورد علاقه از بافت آزاد نیستند، یکی دیگر از روش  های تفکیک را استفاده کنید.

5. اگر سلول از بافت جدا شده اما مرده اند، روش تفکیک خفیف تری را استفاده کنید.
5. اگر بافت هنوز هم هضم نشده است،  آنزیم های مختلف تفکیک، آنزیم بیشتری، و افزایش دوره تیمار را امتحان کنید.
5. تلقیح پلت ها را در تراکم بالا و پایین انجام دهید. اگر سلول های زنده نوع مورد نظر دیده می شود، انکوبه محیط کشت را ادامه دهید.

 7. چند محیط کشت مختلف و مکمل های مختلف، از جمله سرم، محیط کشت هورمونی، و محیط کشت مشروط را امتحان کنید.

5. درصد نوع سلول های مورد علاقه در محیط کشت و چگونگی این تغییرات در طول مدت زندگی در محیط کشت را تعیین کنید.

 9. اگر هیچ یک از موارد فوق کار نشده است، گونه های مختلف (یا نژاد) حیوانات، سن های مختلف حیوانات، و یا کشت همزمان  سلول های مورد نظر  با سلول های مجاور و یا لاین های سلولی فیدر مرتبط (و یا نه چندان مرتبط)  را امتحان کنید.

10. اگر موفقیت داشته اید، دستاوردهای خود را منتشر کنید.

 • انتشار شرح کاملی از روش مورد استفاده برای استخراج کشت سلولی اولیه برای تمام محققانی که بعدها ممکن است از این سلول ها استفاده کنند بسیار  مهم است.

 •  نشریه اولیه همیشه باید در نشریات بعدی استفاده از سلول ها ذکر شود.

Subcultureکشت مجدد

کشت مجدد فرآیندی است که برای تهیه مواد غذایی تازه و فضای رشد برای تیره های سلولی در حال رشد انجام می پذیرد. تعداد کشت مجدد و نسبت ظرفهاsplite ratio  یا تراکم ظرف ها، وابسته به نوع سلول ها می باشد. اگر سلول ها در ظرف های زیاد و در تراکم خیلی کمی  تقسیم شوند، ممکن است سلول ها ناپدید شوند. اگر سلول ها به طور کافی تقسیم نشوند. ممکن است  محیط کشت کاملا  خالی شود و سلول ها بمیرند. به طور معمول، بایستی زمان و نسبت ظرف ها که برای یک تیپ سلولی خاص وجود دارد، به طور دقیق رعایت شود. در عمل، کشت مجدد شامل برداشتن محیط کشت، شستن ظرف و جداسازی سلول های چسبیده به آن، به کمک آنزیم می باشد.( اگر چه بسیاری از سلول ها به وسیله پیپت کردن یا خراشیدن آرام جدا می شوند) و سوسپانسیون رقیق شده سلول ها را به محیط کشت تازه انتقال می دهند.

 اگر محیط کشت بدون سرم باشد لازم است به کمک مهار آنزیمی مانند مهار کننده تریپسین ،محیط خنثی شود.

اگر سرم استفاده شود و یا نسبت ظرف ها پایین باشد(1به 100)نیازی به مهار آنزیمی نیست. اما اگر سلول ها در نسبت ظرفی بالا (1به 2 و یا 1به 5) قرارگیرند لازم است که مهار آنزیمی صورت گیرد .حتی اگر سرم هم استفاده شده باشد.

روش کار:

1. برداشتن محیط کشت از ظرفها:

الف. اگر سلول ها به شدت به ظرف چسبیده باشند، محیط کشت ممکن است کنار گذاشته شود

ب. اگر بیشتر سلول ها در ظرف شناور باشند یا کمی چسبیده باشند با پیپت کردن و تکان دادن آرام   سلول های نگهداشته شده را گرفته و با سلولهای جدا شده با تریپسین مخلوط می کنند.

2-شستشو با سالین فسفات(PBS)

3-دو تا سه میلی لیتر تریپسین اضافه می شود. اجازه داده می شود تا تریپسین کل ظرف را بپوشاند

4-آنرا  در انکوباتور با دمای 37 درجه قرار میدهند. زمان متفاوت است و وابسته به نوع سلول و کشت اولیه و پایداری تیره های سلولی می باشد ولی معمولا بین 2تا 3 دقیقه می باشد. یک ایده خوب وجود دارد که بعد از 2 دقیقه، پلیت یا ظرف را از انکوباتور درآورده و به آن نگاه کنیم و بعد از آن هر یک دقیقه یک بار آنرا چک کنیم.

5-هنگامی که سلول ها گرد  هم آمدند و مایع رویی دور ریخته شد 5 میلی لیتر محیط کشت حاوی سرم  به آن اضافه کرده و سلول ها را در دور 800 سانتریفیوژ  قرار می دهیم. اگر نسبت تقسیم ظرف ها کم باشد (1 به 50) می توان این مرحله را حذف کرد. بخصوص اگر محیط حاوی سرم باشد.اگر بدون سرم باشد، تریپسین به کمک یک میلی لیتر از محلول  1mg/mlمهار کننده تریپسین خنثی می گردد و سپس سانتریفیوژ با دور 900 صورت می پذیرد.

• تعداد سلول ها در یک ظرف فرهنگ در شرایط آزمایشگاهی تعادل بین نرخ رشد سلول، و یا میتوز، و مرگ سلولی است. بنابراین، توانایی افتراق بین سلول های زنده و مرده بنابراین مهم است.

• سلول را می توان قبل از شمارش، در طول و بعد از راه اندازی یک آزمایش به دقت و به طور مستقیم نظارت و استاندارد شرایط تجربی. • برای این منظور معمولا از دو روش می توان استفاده کرد:

1. روش تریپان بلو

2.  روش Acridine نارنجی-بروماید برومید

• روش تریپان بلو

• این روش شمارش افتراقی سلول که حذف تریپان بلو (زنده) و کسانی را که تا رنگ (مرده) است.

• در این روش سلول زنده و مرگ با استفاده از یک hemacytometer یا ذرات ضد الکترونیکی شمارش شد

• hemacytometer است که بدون شک ارزان ترین و روش فشرده کار برای شمارش سلول، اما می توان آن را مورد استفاده برای ارائه داده ها به عنوان دقیق که که به دست آمده توسط هر روش دیگر و به ارائه یک ارزیابی از هر دو تعداد سلول ها و قابل دوام.

مصالح

1. کشت سلولی Trypsinized 2. بهبود hemacytometer Neubauer با لامل 3. مبارزه با

4. 0.4٪ تریپان بلو در PBS 5. پیپت پاستور 6. میکروسکوپ

روش

1. یک 1: 1 رقت از سوسپانسیون سلولی با 0.4٪ تریپان بلو. این می تواند بیشتر با PBS در صورت لزوم رقیق.

2. دقت دوباره به حالت تعلیق با پیپت پاستور.

3. پوشش محفظه hemacytometer با لامل و یک قطره از سوسپانسیون از پیپت پاستور در لبه از "V" شکل در اتاق.

• تکرار برای طرف دیگر از اتاق. این مهم است که زیاد پر نکنید و یا underfill، بلکه اجازه می دهد تا قطره به بیش از سطح با ظرافت کشیده شود.

• 4. محل اتاق به مرحله میکروسکوپ.

• 5. در ابتدا در خطوط اچ اتاق با کم (4 ×) قدرت تمرکز می کنند.

• 6. hemacytometer شامل نه 1mm2 مربع است که به 25 مربع کوچکتر تقسیم شده است. حجم یک مربع 1mm2 0.1 MM3 یا 10- 4 میلی لیتر است (1mm3 = 0.001ml). با استفاده از یک هدف 10 ×، در یکی از 25 مربع کوچکتر در همه طرف توسط سه خط موازی محدود تمرکز می کنند.

 hemacytometer نشان داده شده است می تواند به عنوان یک روش ارزان برای تعیین تعداد سلول زنده استفاده می شود.

• برای تعداد سلول زنده، تعداد دفعات مشاهده تمام سلول های که حذف رنگ. برای برآورد درصد زنده ماندن به طور جداگانه سلول آبی و کسانی که رد رنگ حساب کند.

• چند دکمه ضد اینجا بسیار مفید است.

• به منظور سلول که در مرز دروغ، شمارش سلول که در خط وسط در بالا و سمت راست دروغ و نه در خط وسط در پایین و سمت چپ بستگی به گرایش خود را حساب کند.

7. تعداد حداقل 100 سلول / mm2 در برای محاسبه درصد زنده ماندن سلولها. اگر شما تعداد دفعات مشاهده کمتر از 100 سلول در مربع، تعداد یک یا اضافی تر مربع.

8. تکرار برای طرف دوم از اتاق.

9. برای محاسبه تعداد سلول / میلی لیتر، ضرب تعداد سلول های شمارش در 1mm2 مربع (یا به طور متوسط از این حال بسیاری از میادین شما شمارش) توسط 10- 4.

روش 2. Acridine نارنجی-بروماید برومید

• این روش بسیار آسان می باشد برای دیدن سلول و انجام شمارش دیفرانسیل.

• میکروسکوپ فلورسنت با یک فیلتر مناسب، با این حال، مورد نیاز است.

• هر دو پرتقال acridine و اتیدیوم بروماید رنگ intercalating DNA و در نتیجه جهش زا هستند. حمل و تخلیه با مراقبت.

 بروماید برمید رنگ است که تنها قادر به از طریق غشاء سلول مرده عبور است. نارنجی Acridine رنگ غشاء نفوذ پذیر است که تمام سلول ها در نمونه رنگ است.

 EB نیز بیش از AO حکمفرما می شود.

مصالح

1. Trypsinized و آماده سوسپانسیون سلولی.

2. بروماید برمید-acridine نارنجی (EB-AC) راه حل سهام: اتیدیوم بروماید، 50 میلی گرم. نارنجی acridine، 15 میلی گرم. حل در اتانول 1 میلی لیتر 95٪ و افزایش برای کل حجم 45 میلی لیتر در آب تصفیه شده. فروشگاه در مقادیر یکسان 1ml در درجه -20C.

3. PBS

روش

1. ایجاد یک راه حل کار EB-AC با رقیق نمونه 1ml از محلول را به 100 میلی لیتر PBS. این را می توان تا 1 ماه ذخیره می شود، نور تنگ، در 4C درجه.

2. مخلوط حجم مساوی از سوسپانسیون سلولی: EB-AC.

3. با یک پیپت پاستور اضافه کردن یک قطره (100 لیتر)، در یک اسلاید و پوشش با لامل.

4.Observe با یک میکروسکوپ فلورسنت.

5.Count سلول زنده / مرده با یک شمارنده.سلول های زنده سبز فلورسنت خواهد شد و سلول های مرده خواهد نارنجی فلورسنت.

6.Determine درصد از زنده ماندن با محاسبه: (سلول های زنده / تعداد سلول شمارش) × 100.

 انجماد

مصالح

1. متوسط انجماد. این باید 90 درصد متوسط رشد طبیعی و 10 درصد گلیسرول یا 10٪ دیمتیل سولفواکسید به عنوان یک عامل cryoprotective باشد.

2. ویال انجماد، 2 میلی لیتر یا 5 میلی لیتر.

3. ظرف انجماد.

روش

1. سلول از صفحه حذف با استفاده از تریپسین یا هر عامل به طور کلی استفاده به خرده فرهنگ سلول.

2. سلول های یک بار توسط سانتریفوژ ملایم بشویید در محیط کشت تازه.

3. دوباره به حالت تعلیق در محیط انجماد در تراکم سلول مورد نظر.

4. شرایط استریل پیپت سوسپانسیون سلولی به ویال انجماد.

  ویال انجماد می تواند پلی پروپیلن و یا شیشه ای.

  ویال شیشه ای باید از شعله مهر و موم شده و سپس نشت های غوطه وری در حمام رنگ قبل از انجماد آزمایش می شود.

  ویال چکه کن نه تنها ممکن است به فرهنگ آلوده متقابل منجر شود، آنها ممکن است در ذوب منفجر شود، به عنوان نیتروژن که در طول ذخیره سازی وارد به سرعت گاز می شود و گسترش می یابد.

با این حال، سلول های منجمد در ویال شیشه ای نمی خواهد به طور غیر منتظره و در نتیجه نشت متقابل آلوده فرهنگ، این یک روش پر زحمت تر و وقت گیر است.

  اکثر آزمایشگاه های کوچک در حال حاضر ویال انجماد پلی پروپیلن استفاده کنید.

  آیا سلول در نیتروژن مایع در هر نوع ظرف دیگر از کسانی که طراحی شده برای ذخیره سازی سلول منجمد منجمد نشده است و یا فروشگاه.

  بسیاری از پلاستیک در دماهای نیتروژن مایع شکننده تبدیل خواهد شد و منفجر زمانی که برداشته، احتمالا زخمی پرسنل آزمایشگاهی.

5. برچسب هر ویال به صورت جداگانه با تعیین و تصویب تعدادی از سلول ها، از تاریخ انجماد، و حرف اول شخص انجماد سلول.

  این مهم است که هر ویال برچسب، نه فقط یک برچسب قرار داده شده بر روی جعبه و یا عصا.

  جعبه و ویال را می توان کاهش یافته است، و بیشتر از نه، فقط آن دسته از صورت جداگانه برچسب خواهد نجات باشد.

بسیاری از ویال انجماد یک منطقه از سطح مناسب برای نوشتن بر روی با پاک نشدنی (مطمئن شوید که پاک نشدنی در حلال های آلی و نیتروژن مایع است) قلم جوهر.

  اگر برچسب برای ضبط شود و یا چسب در، مطمئن شوید که چسب درجه حرارت نیتروژن مایع را تحمل کند.

  هیچ چیز کاملا بنابراین نا امید کننده به عنوان یک فریزر پر از ویال از مجموعه ارزشمند خود را از سلول های منجمد وجود دارد، همه که برچسب در پایین مخزن می باشد.

6. سلول باید به آرامی یخ زده.

 کاهش مداوم یک درجه در هر دقیقه ایده آل است.

  این باید حداقل 4 ساعت برای رسیدن به دمای نیتروژن مایع را.

  ماشین آلات که ویال در این نرخ دقیق آن مسدود وجود دارد. با این حال، این است که به وضوح هزینه مورد نیاز برای متوسط آزمایشگاه کشت سلولی نیست.

ویال از سلول باید در یک قفسه انجماد و یا دندانه دار کردن لوله پلی استایرن پلاستیکی قرار می گیرد.

 دندانه دار کردن و یا ظرف باید در یخچال به مدت 30 دقیقه قرار داده، سپس به -80C درجه فریزر، که در آن باید به مدت حداقل 60 دقیقه از یک شب باقی می ماند و دیگر نقل مکان کرد.

 ویال ممکن است از ظرف انجماد به فریزر نیتروژن مایع منتقل می شود.

انجماد ظرف (دندانه دار کردن

روش دیگر، تولید کنندگان مخزن نیتروژن را گردن ارزان انجماد که مناسب مخازن استاندارد خود را. این جایگزین کلاه عایق و دارای ویال بالا در گردن از مخزن، اجازه می دهد آنها را به آرامی با بخار نیتروژن یخ زده می شود.

سلول ممکن است برای مدت کوتاهی در -80C درجه ذخیره می شود، اما آنها ادامه خواهد داد به انحطاط به سرعت در این دما و بنابراین باید در -80C درجه برای بیش از چند هفته ذخیره شده نیست.

تجهیزات برای انجماد و ذخیره سازی سلول های در دمای نیتروژن مایع. سه وجود دارد

مخازن مختلف اندازه

سلول های منجمد باید در درجه -180C ذخیره می شود. این دمای نیتروژن مایع است.

  مخازن ذخیره سازی سلول، ساخته شده توسط تولیدکنندگان مختلف، بطور خاص طراحی شده که مسئولیت رسیدگی به این درجه حرارت پایین.

 مخزن خوب باید "زمان برگزاری" طولانی (مقدار زمان طول می کشد تمام نیتروژن مایع تبخیر اگر مخزن پر نشده است)، برگزاری یک تعداد منطقی زیادی از ویال، و یک سیستم موجودی خوبی برای ذخیره سازی و پیدا کردنویال.

  برخی از نوع زنگ و یا یک سیستم پر کردن خودکار بسیار مفید است.

عاقلانه به ذخیره ویال های یخ زده این خطوط سلولی در حداقل دو فریزر جداگانه به طوری که همه چیز را از دست داده است اگر خشک می رود به دلیل بی دقتی و یا نقص در مخزن است.

  به یاد داشته باشید که این تجهیزات، هر چند معمولا در گوشه گیر، شامل قلب یک آزمایشگاه کشت سلولی و ممکن است سلول غیر قابل تعویض و فرهنگ که در هیچ جای دیگری ذخیره شده باشد.

ویال منجمد سلول اغلب در آزمایشگاه ماندن طولانی پس از دانش آموزان، همکاران، و یا تکنسین که آنها را مسدود و آنها را قرار داده شده در مخزن از بین رفته است. بنابراین، یک سیستم رکورد نگه داشتن خوب یک بخش اساسی از ذخیره سازی سلول است.

هر ویال از سلول باید با نام کامل سلول، تعداد عبور، تاریخ، و نام و یا حرف اول شخص در حال رشد و انجماد سلول برچسب.

 سیستم آزمایشگاهی گسترده باید به منظور حفظ سوابق از آنچه سلول منجمد، که چگونه بسیاری از ویال منجمد، که آنها را مسدود، چرا آنها در آن زمان منجمد شده بودند، و جایی که آنها ذخیره می شوند.

در صورتی که یک کامپیوتر آزمایشگاه به راحتی در دسترس وجود دارد، پرونده را می توان در یک پایگاه داده در کامپیوتر نگهداری می شود.

  یکی از اعضای آزمایشگاه می تواند مسئول قرار دادن سلول های در فریزر و از بین بردن سلول های به ذوب شود.